• Die Chromatographie gehört zu den Verfahren, bei denen Stoffgemische untersucht werden, indem man sie in ihre einzelnen Bestandteile auftrennt (Trenntechniken oder Separationsverfahren).
   
• Man kann damit das Vorhandensein von Stoffen nachweisen und ihre Konzentration bestimmen (analytische Chromatographie). Man kann Stoffe auch zur weiteren Verwendung isolieren (präparative Chromatographie).
   
• Basis der Auftrennung der Stoffe ist die unterschiedliche Verteilung der Stoffe in zwei Phasen. Die mobile Phase (Flüssigkeit oder Gas) bewegt sich an der stationären Phase (Feststoff oder Flüssigkeit) vorbei und nimmt die Stoffe dabei unterschiedlich schnell mit.
    
• Bei der planaren Chromatographie (Flachbett-Chromatographie) läuft die Trennung auf Papier oder einer beschichteten Glasplatte bzw. Kunststofffolie ab (Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie).
   
• Im medizinischen Labor sind heute Techniken gebräuchlicher, bei denen sich die stationäre Phase in einer Säule befindet, durch die die mobile Phase fließt (Säulen-Chromatographie). Dazu gehören die Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und die Gaschromatographie (GC).

Woher kommt der Name Chromatographie?

Die erste Beschreibung der Technik geht auf den russischen Botaniker Tswjett zurück, der um 1900 damit verschiedene Farbpigmente von Pflanzen aufgetrennt hat. Daraus ergab sich der Name (chroma und graphein: Griechisch für Farbe bzw. schreiben, zeichnen).
Eine andere Deutung bringt den Namen des Botanikers ins Spiel. Tswjett heißt nämlich ins Deutsche übersetzt Farbe.

Was ist die Chromatographie?

Die Chromatographie gehört zu den Verfahren, bei denen Stoffgemische untersucht werden, indem man sie in ihre einzelnen Bestandteile auftrennt. Nach der Trennung kann man erkennen, welche Bestandteile in dem Stoffgemisch vorliegen und in welcher Konzentration. Die Chromatographie gehört damit zu den sog. Separationstechniken (Trenntechniken). Andere Trenntechniken sind z.B. die Elektrophorese oder die Zentrifugation.

Worauf beruht die Trennung bei der Chromatographie?

Bei der Chromatographie ist die Grundlage der Auftrennung die unterschiedliche Verteilung verschiedener Stoffe zwischen zwei Phasen. Dabei ist eine Phase stationär  - stationäre Phase (z.B. ein Magnesiumsilicat-Pulver in einer Glassäule). Die andere, die mobile Phase, bewegt sich an den Teilchen der stationären Phase vorbei (z.B. eine durch die Säule fließende Flüssigkeit). Hält sich ein Stoff bevorzugt an/in der stationären Phase auf, wird er nur langsam mit der mobilen Phase mitwandern. Hält er sich vorwiegend in der mobilen Phase auf, wird er rasch mitwandern.

Bevor weitere Erklärungen verwirren könnten, sei der Ablauf einer chromatographischen Trennung schematisch dargestellt:
Die grauen Quadrate stellen die stationäre Phase dar, die sich in einer Säule befindet. Die mobile Phase, in diesem Fall eine Flüssigkeit, ist blau dargestellt. Die Kugeln sind die aufzutrennenden Stoffe.

Am Anfang (1) ist das Stoffgemisch am oberen Rand der stationären Phase. Dann lässt man die Flüssigkeit durch die Säule fließen (2). Die Stoffe werden von der Flüssigkeit mitgenommen. Aber verschieden schnell (3)! Die roten Kugeln laufen fast so schnell wie die Flüssigkeit. Sie kommen bald zum Säulenausgang (4) und könnten dort gemessen oder aufgefangen werden, die grünen kommen später (5), die blauen kommen kaum vorwärts. Ergebnis: Das Stoffgemisch wurde aufgetrennt.

Aber warum erfolgte diese Auftrennung, warum waren die roten so schnell und die blauen so langsam?
 
Dafür sind zwei Faktoren wichtig:

• Wie groß ist die Affinität der Stoffe zur stationären Phase?
  Wie stark werden die Stoffe an die stationäre Phase gebunden. Wird ein Stoff stärker gebunden, hält ihn das länger auf, er wandert langsamer. Wird er kaum gebunden wandert er schneller.
  
• Wie groß ist die Affinität der Stoffe zur mobilen Phase?
  Wie stark sind die Stoffe in der mobilen Phase gebunden. Ist ein Stoff in der mobilen Phase schlecht löslich, dann "will ihn ja die mobile Phase gar nicht haben" und wird sich leichter an die stationäre Phase binden. Er wird dann langsamer wandern. Ein in der mobilen Phase gut löslicher Stoff wird schneller wandern.

So kommen wir zur allgemeinen Definition der Chromatographie zurück: die Trennung beruht auf der unterschiedlichen Verteilung der Stoffe zwischen der stationären und der mobilen Phase.

Nicht bei jeder Art von Chromatographie spielen diese 2 Faktoren eine gleich große Rolle. Oft ist die unterschiedliche Bindung der Stoffe an die stationäre Phase der wichtigere Faktor zur Auftrennung, während die Affinität der Stoffe zur mobilen Phase ziemlich ident ist.

Welche Mechanismen sind es, die Stoffe verschieden stark zurückhalten können? Was ermöglicht die Auftrennung?

Es gibt unzählige Variationen und Anwendungen der Chromatographie, im Grunde sind es aber nur wenige Mechanismen, die dabei ausgenützt werden:

In Wirklichkeit wirken meist verschiedene Mechanismen zusammen. Oft ist ein Mechanismus der dominierende, aber auch andere spielen eine Rolle.

1. Das "Molekül-Sieb" (Gelfiltrations-Chromatographie)

Das Wesentliche der Trennung bei der Gelfiltrations-Chromatographie ist eine stationäre Phase aus einem Material mit löchriger, porentragender Oberfläche. Diese Löcher sind wie Fallen. Fließen die zu trennenden Stoffe in der mobilen Phase daran vorbei, werden die großen Teilchen unbehindert durchfließen. Die kleinen aber werden sich in den Löchern immer wieder vorübergehend verfangen. Je kleiner ein Stoff (je kleiner die Molekülgröße) um so langsamer wird er durch die stationäre Phase wandern*.

Trennung durch "Molekül-Sieb" Die Trennung der Stoffe beruht vor allem auf ihrer unterschiedlichen Molekülgröße: An der löchrigen Oberfläche der stationären Phase (dunkelgraue Flächen) bleiben die kleineren, grünen Kugeln leicht hängen und werden dadurch aufgehalten. Die größeren, orangenen etwas weniger. Je kleiner die Teilchen, desto langsamer wandern sie*. *Gilt nur bis zu einer gewissen Größe. Unter dieser Größe wandern alle Stoffe gleich langsam, man kann sie nicht weiter auftrennen.

Die blauen Kugeln sind größer als die Poren der stationären Phase - sie werden gar nicht aufgehalten. Sie wandern am schnellsten. Stoffe über einer gewissen Größe werden gleich schnell wandern (man nennt diese Größe die Ausschlussgrenze).
Es ist durch die Abbildung gut nachvollziehbar, dass auch die Form der Teilchen einen Einfluss auf die Wanderungsgeschwindigkeit haben wird.

Stationäre Phasen für die Gelfiltration (auch Size-Exclusion-Chromatography): Materialien mit porösen Partikeln, die im einfachsten Fall in eine Säule gepackt werden. In Frage kommen z.B. Dextran (Sephadex®), Agarose (Sepharose®) oder Polyacrylamid (Biogel®).
Eine typische Anwendung wäre die Auftrennung von Proteingemischen nach der Molekülgröße.

2. Adsorptionsphänomene (Adsorptions-Chromatographie)

Die Adsorption, also Anlagerung eines Stoffes an einen anderen, wird durch Anziehungskräfte, die zwischen Stoffen bestehen können, verursacht. Diese Anziehungskräfte führen zu Anlagerungen ohne feste chemische Bindung, eben zur Adsorption.
Verschiedene Stoffe werden an andere verschieden stark adsorbiert. Darauf beruht das Prinzip der Trennung bei der Adsorptions-Chromatographie.

Trennung durch Adsorption Die Trennung der Stoffe beruht auf der unterschiedlichen Adsorption der Stoffe an der stationären Phase (dunkelgraue Flächen). Der zweite Faktor: wie groß ist die Affinität der Stoffe zur mobilen Phase, wie stark sind die Stoffe in der Flüssigkeit gebunden. Die blauen Kugeln werden weniger stark von der stationären Phase adsorbiert und/oder sind stärker in der mobilen Phase gebunden und wandern daher schneller.

Welche Kräfte zur Adsorption führen, ist nicht einfach zu beschreiben. Natürlich gibt es eine Menge theoretischer Erklärungen, dies würde aber hier zu weit führen.

Typische Adsorptionsmittel,die sich als stationäre Phase eignen sind Siliziumoxide (Kieselgur, Kieselgel), Magnesiumsilicat, Magnesiumoxid oder Aluminiumoxid.

Anwendungen: Adsorptionsphänomene haben bei vielen, ja theoretisch bei allen chromatographischen Auftrennungen Einfluss auf die Trennung. Von entscheidender Bedeutung sind sie bei der Dünnschichtchromatographie und bei vielen Anwendungen der Gaschromatographie.

3. Verteilungsphänomene (Verteilungs-Chromatographie)

Die verteilungschromatographischen Effekte beruhen auf der unterschiedlichen Verteilung von Stoffen in zwei Flüssigkeiten (oder einem Gas und einer Flüssigkeit). Die eine Flüssigkeit ist die stationäre Phase (z.B. der Wassermantel der Zellulosefasern bei der Papier-Chromatographie). Die andere Flüssigkeit ist die mobile Phase (z.B. Butanol). Je nachdem zu welcher Flüssigkeit der Stoff mehr Affinität hat, in welcher er besser löslich ist, desto schneller oder langsamer wird er wandern.

Trennung durch Verteilung Die Trennung der Stoffe beruht auf der unterschiedlichen Verteilung in der Flüssigkeit der stationären Phase (blaue Streifen) und der Flüssigkeit der mobilen Phase (hellblau). Die blauen Kugeln lösen sich besser in der stationären Phase, sie werden dadurch zurückgehalten und wandern langsamer. Die roten lösen sich kaum in der stationären Phase sie wandern rasch mit der mobilen Phase mit.

Anwendungen: Verteilungsgleichgewichte spielen praktisch bei allen chromatographischen Verfahren eine Rolle. Besonders typisch bei der Papierchromatographie (siehe weiter unten).

Auch in der Gaschromatographie spielen Verteilungen eine große Rolle. Dabei handelt es sich um Verteilungen zwischen einem Gas (mobile Phase) und Flüssigkeiten (stationäre Phase).

4. Ionen-Austausch-Chromatographie (Ion-Exchange-Chromatography)

Bei der Ionen-Austausch-Chromatographie sind an der stationären Phase Gruppen gebunden, die eine positive oder negative Ladung tragen und daher entgegengesetzt geladene Teilchen binden und damit zurückhalten können.

a. Stark vereinfachte Darstellung zum Einstieg

Ladungen stehen im Mittelpunkt Die stationäre Phase trägt Ladungen. Entgegengesetzt geladene Teilchen bleiben daran hängen. Ungeladene oder gleich geladene gehen schneller durch. Im Beispiel hat die stationäre Phase negative Ladungen, es werden daher positiv geladene Teilchen (=Kationen) gebunden (Kationen-Austausch-Chromatographie). Es gibt auch den umgekehrten Fall, dass die stationäre Phase positive Ladungen trägt und so negativ geladene Teilchen (=Anionen) zurückhält: (Anionen-Austausch-Chromatographie).

Aus dem einfachen Schema wird noch nicht klar, warum es Ionen-Austausch-Chromatographie heißt.

Das Schema ist also zu erweitern:

• Bei der Ionen-Austausch-Chromatographie sind in der mobilen Phase ebenfalls Ionen. Und diese konkurrieren mit denen der Probe. Sie verdrängen die Ionen der Probe von den Bindungsstellen an der stationären Phase. Sie tauschen diese also aus. Je stärker ein Stoff an die Ladungen der stationären Phase gebunden ist, um so weniger wird er sich austauschen lassen, um so länger wird er zurückgehalten. Das ist das Prinzip der Trennung.
   
• In obiger Abbildung ist dargestellt, wie ein ungeladener Stoff schneller durch die stationäre Phase geht. Das kann bei der Ionen-Austausch-Chromatographie eine Rolle spielen.
  Oft trennt man aber nicht ungeladene von geladenen Stoffen sondern ein Gemisch geladener Stoffe, die sich mehr oder weniger stark an die stationäre Phase binden.

b. Weniger übersichtliche aber realistischere Darstellung einer Ionen-Austausch-Chromatographie

Kationen-Austausch-Chromatographie Die in der mobilen Phase befindlichen Kationen (weiße Kugeln) konkurrieren mit den roten und orangenen Kationen der Probe um die negativ-geladenen Bindungsstellen der stationären Phase. Die orangenen Kugeln binden dabei relativ schwach an die stationäre Phase, sie werden von den grauen Kationen leicht verdrängt und kommen daher schneller weiter. Die roten Kugeln binden sich stärker an die stationäre Phase und kommen daher nicht so schnell weiter.

Es mag an dieser Stelle zu weit führen, ist aber anhand der Abbildung gut zu verstehen: Wie erreicht man, dass die Stoffe der Probe schneller durch die stationäre Phase gehen? Indem man die Konzentration der Kationen der mobilen Phase ("der grauen Kugeln") erhöht. Dann werden die Stoffe in größerem Ausmaß verdrängt. Oder, indem man die Ladung der Stoffe ändert. Das funktioniert bei manchen Stoffen indem man den pH der mobilen Phase verändert. Dies sei deswegen erwähnt, weil diese beiden Punkte die zentralen Faktoren der klassischen Auftrennung von Aminosäuren mittels Kationen-Austausch-Chromatographie sind.

Anwendung: am häufigsten wird der Ionen-Austausch-Effekt bei der Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) eingesetzt (siehe weiter unten).

5. Affinitäts-Chromatographie

Der Affinitäts-Chromatographie liegt eine ganz spezielle Wechselwirkung zwischen Strukturen der stationären Phase und den Stoffen in der mobilen Phase zu Grunde. Ein Beispiel wäre die Wechselwirkung zwischen Antigenen und Antikörpern, ein anderes die von Hormonen mit ihren Rezeptoren, oder die von Enzymen mit ihrem Substrat.

Trennung bei der Affinitäts-Chromatographie An der stationären Phase sind Strukturen (schwarz eingezeichnet), die wie ein Schlüssel zum Schloss zu Strukturen auf einem Stoff in der Probe passen. Dieser Stoff (blaue Kugeln, oben) wird daher langsamer durch die stationäre Phase wandern, als Stoffe, die diesen Rezeptor nicht haben (blaue Kugeln, unten).

Wird im Routinelabor selten eingesetzt werden. Für die Analyse von Stoffen wird es oft zu aufwändig sein, will man aber Stoffe isolieren, reinigen und weiter verwenden (präparative Chromatographie), könnte man die Technik einsetzen.

Beispiel: Nachweis von Anti-HIV-Antikörpern
Eine spezielle Anwendung, die man zur Affinitätschromatographie zählen könnte, ist der Nachweis von Antikörpern mit Hilfe von Teststreifen:

	Auftragen des Serumtropfens (es kann auch Vollblut verwendet werden).
	Rechts: oben positives und unten negatives Ergebnis.

Planare und Säulen-Chromatographie

• Bei der planaren Chromatographie findet die Trennung auf einer flachen Oberfläche statt (auch Flachbett-Chromatographie genannt). Beispiele sind die Papierchromatographie und die Dünnschichtchromatographie.
   
• Bei der Säulen-Chromatographie ist die stationäre Phase in eine Säule (meist aus Glas oder Stahl) gepackt oder sie überzieht die Innenwand einer sehr langen Kapillarsäule (aus Glas). Beispiele sind die Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie und die Gaschromatographie.

Analytische und präparative Chromatographie

In der Labormedizin möchte man meist nur analysieren, ob und in welcher Konzentration ein Stoff vorhanden ist. Dazu dienen analytische Verfahren wie auch die analytische Chromatographie. Will man einen Stoff aber nicht nur analysieren sondern auch zur Weiterverwendung reinigen und gewinnen, muss man die Verfahren etwas abändern. Man spricht dann von präparativer Chromatographie.

	Analytische Chromatographie am Beispiel der Säulen-Chromatographie Der Detektor registriert den aus der Säule tretenden Stoff. Für analytische Anwendungen möchte man eher geringe Probenmengen verwenden. Und das ist meistens auch möglich, solange die Menge groß genug ist, um im Detektor ein klares Signal zu auszulösen. Bei geringen Probenmengen kann man relativ kleine Säulen verwenden.
	Präparative Chromatographie am Beispiel der Säulen-Chromatographie Hält man zur richtigen Zeit ein Gefäß unter das Ende der Säule, kann man den Stoff einsammeln. Hierbei möchte man manchmal sehr große Mengen gewinnen. Dazu muss man auch große Probenmengen einsetzen, wodurch der Einsatz sehr großer Säulen notwendig werden kann.