In der Einführung zur Durchflusszytometrie war doch alles ganz einfach beschrieben: Man markiert die Lymphozyten mit einem grünen Fluoreszenzfarbstoff (z.B. CD8-FITC) und mit einem roten (z.B. CD4-PE). Dann lässt man die Probe durch das Durchflusszytometer laufen. Die Grünfluoreszenz der Zellen misst das Zytometer im FL1-Kanal (FITC-Kanal, 525 nm Wellenlänge), die Rotfluoreszenz im FL2-Kanal (PE-Kanal, 575 nm).

Man erhält so eine ideale Trennung: Die mit FITC markierten Zellen sind nur im FITC-Kanal positiv, die mit PE markierten nur im PE-Kanal:

Ergebnis einer Färbung mit CD8-FITC und CD4-PE bei korrekter Kompensation Die in der Darstellung grün eingefärbten Zellen sind CD4 komplett negativ, die rot-eingefärbten sind CD8-komplett negativ. So wie man sich das auch wünschen würde, weil eine CD8-T-Zelle kein CD4 exprimiert und eine CD4-positive T-Zelle kein CD8. Anmerkung: die grüne bzw. rote Einfärbung der Zellen ist willkürlich. Sie dient nur der Hervorhebung der Populationen.

Das funktioniert aber nur, weil die Messwerte der Zellen rechnerisch korrigiert, man sagt "kompensiert" wurden. Ohne diese rechnerische Kompensation sähe der Plot ganz anders aus:

Ergebnis einer Färbung mit CD8-FITC und CD4-PE OHNE Kompensation So sieht das ohne Kompensation aus. So sehen die echten Messwerte aus, die das Durchflusszytometer misst. Es gibt praktisch nur doppelt positive Zellen: Alle Zellen sind in beiden Kanälen stärker fluoreszierend als die negativen Zellen (schwarz).

Dieser Plot schaut weniger schön aus. Unsere CD8-positiven Zellen (in grün) scheinen alle auch CD4-positiv. Und unsere CD4-positiven (in rot) scheinen auch CD8-positiv zu sein.
Das entspricht aber nicht der Biologie der Zellen, denn die CD8-positiven sollten nicht CD4-positiv sein und die CD4-positiven nicht CD8-positiv (zumindest im Blut). Die unkompensierte Darstellung führt also zu eigenartigen Ergebnissen.

Um die Sache zu vereinfachen, färben wir einmal nur mit CD8-FITC, dann sollten doch keine doppelt-positiven Zellen auftreten, denn wir gaben ja gar keinen "roten" Antikörper dazu:

Ergebnis einer Färbung nur mit CD8-FITC OHNE Kompensation Obwohl wir gar keinen "roten" Antikörper dazugeben, erscheinen die CD8-positiven Zellen auch im Kanal FL2 (dem "roten" Kanal) positiv.

Dieser Plot sieht auch nicht besser aus. Alle CD8-positiven Zellen sind auch im zweiten Kanal positiv. Warum ist das so? Vor dem Detektor des zweiten Kanals (FL2) ist doch ein Farbfilter, das Grün gar nicht durchlässt.

Ursache: FITC leuchtet nicht nur grün
In unserer idealisierten Vorstellung leuchtet eine FITC-positive Zelle nur grün. Weil FITC ein grüner Fluoreszenzfarbstoff ist. Leider ist das nicht so. FITC leuchtet nicht nur grün. Es leuchtet zwar grün am stärksten aber es leuchtet auch auf vielen anderen Wellenlängen.
Die Wellenlängen die FITC ausstrahlt, kann man am besten mit einem Wellenlängen- oder Frequenzspektrum darstellen. Da es um die Ausstrahlung geht, nennt man das Emissionsspektrum.

Das sieht bei FITC so aus:

Emissionsspektrum von FITC FITC strahlt nicht nur grün (Gipfel), es strahlt auch bei größeren Wellenlängen. FITC strahlt auch gelb und rot, wenn auch viel schwächer.

Aus dem Spektrum wird erkennbar: FITC strahlt auch in anderen Farben. Eine FITC-positive Zelle wird daher auch in anderen Kanälen des Durchflusszytometers einen, wenn auch kleineren Impuls auslösen.
Sie mögen jetzt sagen, dass dieser minimale Rotanteil doch nicht so ein starkes Signal in FL2 gemacht haben kann. Die FITC-positiven Zellen lagen doch fast schon in der Mitte der FL2-Achse, etwa bei 300.
Um das zu verstehen muss man sich von einem Vorurteil befreien: PE fluoresziert nicht rot sondern gelb und der FL2/PE-Kanal misst daher nicht rotes Fluoreszenzlicht sondern gelbes. Und der Gelbanteil von FITC ist beträchtlich, wie das obige Spektrum zeigt.
Hintergrundinfo: Die falsche Vorstellung vom "roten" PE ist wahrscheinlich aus der Entwicklung der Durchflusszytometrie erklärbar. Anfangs hatten Durchflusszytometer nur einen Fluoreszenzkanal, meist für FITC, den grünen Farbstoff. Dann kam ein zweiter Farbstoff dazu - das PE. Da sich rot-grüne Darstellungen viel hübscher machen als rot-gelbe wurde das PE oft mit der Farbe rot symbolisiert. Auch die Antikörperhersteller füllten ihre FITC-Antikörper in grüne, die PE-Antikörper in rote Fläschchen. So entstand das falsche Bild vom roten PE.

Jetzt wird klar, warum die FITC-gefärbten Zellen im Durchflusszytometer so aussehen:

Der beträchtliche Gelbanteil der FITC-Fluoreszenz wird im PE-Kanal mitgemessen. Deswegen sind die CD8-positiven Zellen so weit oben.

Ist das überhaupt ein Problem?
Ja, sicher. So kommen z.B. bei bestimmten Lymphomen sehr wohl CD4/CD8-doppelt positive Lymphozyten vor. Dies ist sogar eine große Hilfe bei der Diagnose dieser Krankheiten. Um dies zu erkennen, könnte man die Lymphozyten gleichzeitig mit CD8-FITC und CD4-PE färben. Wenn aber die CD8-Zellen ohnehin schon stark positiv im PE-Kanal sind, weil das CD8-FITC in den PE-Kanal hineinstrahlt, dann ist nur mehr sehr schwer zu erkennen, ob auch das CD4-PE auf den CD8-positiven Zellen sitzt.

Man löst das Problem mit einer rechnerischen Korrektur: Wenn ich weiß, dass FITC auch in den PE-Kanal strahlt, dann weiß ich, dass ich vom PE-Signal, das ich messe, etwas abziehen muss. Nämlich genau den Anteil der vom FITC stammt.
Dazu gibt es in der Software der Durchflusszytometer meist eine spezielles Menü. Dort finden Sie eine Angabe, die vielleicht lautet:

D.h., das FL2 Signal wird folgendermaßen berechnet: vom gemessenen Wert im Kanal FL2 wird ein bestimmter Anteil des Signals in FL1 (dem FITC-Signal) abgezogen. In anderen Worten: der Anteil der des FL2-Signals, der vom FITC kommt, wird vom FL2-Signal abgezogen. Dadurch erhält man den wahren Wert der FL2/PE-Expression der Zellen.
Diesen Vorgang nennt man die Kompensation.

Wie hoch der Prozentsatz ist, den man abziehen muss, wird entweder in einer automatische Kompensationsroutine vom Gerät ermittelt, oder man macht es selbst, was sehr informativ ist.

Wie stellt man die Kompensation ein?

Nachfolgend ein Beispiel zum Einstellen der Kompensation von FL1 gegen FL2.
Die Lymphozyten wurden mit CD8-FITC gefärbt:

	Kompensation: FL2 = FL2 - 0% FL1 Noch einmal zur Erinnerung die unkompensierte Messung. Es ist klar, dass es so nicht bleiben darf. Wir müssen einen Teil des FL1-Signals von FL2 abziehen.
	Kompensation: FL2 = FL2 - 23% FL1 Noch immer viel zu wenig kompensiert: Obwohl wir schon 23% des FITC-Signals von FL2 abziehen, liegen die Zellen immer noch im "FL2-positiven" Bereich. Stark unterkompensiert.
	Kompensation: FL2 = FL2 - 40% FL1 Sieht schon besser aus, aber es reicht noch nicht ganz. Der Haufen stark CD-8-positiver Zellen liegt noch immer höher als der Haufen der negativen (schwarzen) Zellen. Er sollte aber auf gleicher Höhe liegen. Also immer noch unterkompensiert.
	Kompensation: FL2 = FL2 - 45% FL1 Sieht ganz gut aus. Damit könnte man arbeiten. Es gibt viel mehr schwarze als grüne Zellen, sodass die visuelle Beurteilung nicht leicht ist, das Maximum der Zellen scheint etwa in gleicher Höhe. Vielleicht schon ein wenig überkompensiert. Man könnte es mit ein, zwei % weniger versuchen und sich den Median ausrechnen lassen (siehe weiter unten).
	Kompensation: FL2 = FL2 - 49% FL1 Eindeutig zu stark kompensiert. Der Haufen stark CD-8-positiver Zellen liegt tiefer als der Haufen der negativen Zellen: überkompensiert.
	Kompensation: FL2 = FL2 - 55% FL1 Viel zu stark kompensiert. Der Haufen stark CD-8-positiver Zellen ganz gegen die Achse gedrückt: stark überkompensiert.

 
So geht man praktisch vor
So ähnlich wie in den Abbildungen gezeigt kann man die Kompensation tatsächlich einstellen. Man braucht zur Einstellung der Kompensation eine Probe mit zwei Zellpopulationen: eine Population ungefärbter Zellen und eine gefärbter Zellen. Ansonsten sollten die Zellen der beiden Populationen einander möglichst ähnlich sein. Meist wählt man Lymphozyten (indem man diese im Scattergate auswählt). Damit ein Teil der Lymphozyten gefärbt wird, ein anderer aber ungefärbt bleibt, kann man passende Marker nehmen. Z.B. CD4, das färbt nur einen Teil der Lymphozyten. Noch korrekter ist es, wenn man erst einmal 2 Proben vorbereitet. Bei der einen färbt man die Lymphozyten, mit z.B. CD45, bei der zweiten Probe färbt man nicht. Vor der Messung gießt man die 2 Proben zusammen. Man hat jetzt in der Probe eine CD45-positive, gefärbte und eine CD45-negative, ungefärbte Population. Die zwei Populationen sind ansonsten völlig ident.
Monozyten und Granulozyten sind aufgrund der höheren Autofluoreszenz nicht so gut zum Einstellen der Kompensation geeignet.

Muss man die Kompensation so genau einstellen?
Das wäre schon ideal. Bei der Beurteilung stark positiver und deutlich abgesetzter Population ist das Problem nicht so groß. Aber eine Beurteilung schwacher Antigenexpressionen ist bei falscher Einstellung schwierig. Auch bei kontinuierlicher Antigenexpression ("schmierende" Expression) könnten falsche Resultate entstehen.

Es ist nicht so, dass nur die FITC-Fluoreszenz in andere Kanäle streut. Auch das PE strahlt nicht nur gelb, es strahlt auf verschiedenen Wellenlängen, wie sein Emissionsspektrum deutlich macht:

Emissionsspektrum von FITC und PE PE strahlt nicht nur gelb (Gipfel), es strahlt auch bei kürzeren Wellenlängen. Es strahlt auch ein wenig grün. Daher wird ein PE-Signal auch im FL1/FITC-Kanal detektiert.

Daher sieht auch eine mit CD4-PE gefärbte Probe ohne Kompensation nicht optimal aus:

CD4-PE ohne Kompensation Der Grünanteil der PE-Fluoreszenz wird im FITC-Kanal mitgemessen. Deswegen sind die CD4-positiven Zellen so weit rechts.

Versuchen sie selbst die richtige Kompensation zu finden FL1 = FL1 - X % FL2
	Klicken Sie auf die blauen Felder um verschieden starke Kompensationen auszuprobieren

Wie sie sehen, muss man von PE auf FITC nicht allzuviel kompensieren. Das liegt vor allem daran, dass PE nur einen sehr geringen Grünanteil hat (siehe PE-Emissionsspektrum weiter oben). Dennoch muss man ein wenig kompensieren. Von den obigen Möglichkeiten erscheint eine Kompensation von 0.5% das beste Ergebnis zu bringen. 0.3% ist noch unterkompensiert und 0.7% bereits überkompensiert. Bei 0.5% liegt die Population der CD4-positiven Lymphozyten ziemlich genau über der der CD4-negativen Zellen (schwarz dargestellt).

Kann Überkompensation ein Problem sein?
Ja, oft ein größeres als die Unterkompensation. Wenn Sie unterkompensieren, kann es passieren, dass sie eine Population fälschlicherweise für positiv halten. Wenn Sie stark überkompensieren, kann es sein, dass Sie eine schwächer positive Population für negativ halten oder bei starker Überkompensation die ganze Population übersehen, weil sie gegen die Achse gedrückt ist (siehe obiges Beispiel, Button 5).

Technische Anmerkungen

• Manchmal würde man sich beim Einstellen der Kompensation eine zusätzliche Kommastelle wünschen, weil der ideale Wert z.B. zwischen 0.4% und 0.5%, also vielleicht bei 0.45% liegt. Nicht bei allen Durchflusszytometern ist das möglich. Meist ist dies aber auch nicht so wichtig, da die Kompensation sowieso von Antikörper zu Antikörper ein wenig schwankt und daher eine zu genaue Einstellung mit einem bestimmten Antikörper wenig bringt.
   
• Außer der optischen Beurteilung legt man sich natürlich noch eine Region über die positive und negative Population und lässt sich die mediane Fluoreszenzintensität oder das geometrische Mittel der Fluoreszenzintensität anzeigen. Diese Werte sollten bei beiden Populationen etwa gleich sein.
  

Die Kenntnis der nachfolgenden Punkte ist zum Einstellen einer korrekten Kompensation nicht notwendig, vielleicht sind die Fragen aber für Sie von Interesse.

Warum eine hohe Kompensation nicht gut ist

Nach dem Lesen des Obenstehenden könnte man meinen, es macht gar nichts, wenn sich zwei Fluoreszenzfarbstoffe, die man verwendet, weit überlappen. Man kann das ganze ja rechnerisch kompensieren. Prinzipiell ja, es ist aber dennoch nicht zu empfehlen mit sehr hohen Kompensationsfaktoren zu arbeiten. Nicht nur deswegen, weil dann eine leichte Fehlkompensation große Folgen hätte, auch bei optimal eingestellter Kompensation ergeben sich Nachteile:

Messfehler übertragen sich in den anderen Kanal
Stellen wir uns zuerst den idealen Fall vor: eine Probe wird mit z.B. CD45-FITC gefärbt. Sie haben ermittelt, dass die Kompensation zwischen FITC und PE 40% sein muss. Eine Zelle hat ein gemessenes FITC-Signal von 100 und ein gemessenes PE Signal von 40. Sie wissen ja, dass sie jetzt von dem PE-Signal 40% des FITC-Signals abziehen müssen. 40% von 100 sind 40. Das errechnete PE Signal ist das gemessene minus dem FITC Anteil also 40 minus 40. Ergibt 0. Ideal.
In Wirklichkeit ist eine Messung nie fehlerlos, und so kann es sein, dass das FITC-Signal fälschlicherweise mit 90 gemessen wurde. Der PE-Kanal hat richtig gemessen, also 40. 40% von 90 sind aber nur 36. Wenn sie jetzt vom PE-Signal 40% des FITC-Signals, also 36, abziehen bleibt immer noch 4 über. Die Zelle scheint also ein PE-Signal zu haben. Aber nur, weil die Messung im FITC-Kanal nicht korrekt war.
Wird auf der anderen Seite im FITC-Kanal fälschlicherweise zu viel gemessen, wird das PE-Signal fälschlicherweise zu stark kompensiert (in unserem Fall würden dann Minuswerte resultieren, was nicht möglich ist. Wenn aber die Zelle eine echte PE-Expression hätte, würde diese durch die Kompensation dann dann zu stark nach unten korrigiert).

Die Präzision im Nachbarkanal sinkt
In der Summe führt der Effekt zu einer größeren Streuung der PE-Werte.
Wenn der Fehler im FITC-Kanal ein zufälliger Fehler ist, was anzunehmen ist. Einen systematischen hätte man ja bei der Kompensationseinstellung berücksichtigen müssen oder er hätte bei der Analyse auffallen müssen.

Lymphozytenpopulation links ohne Antikörper, recht gefärbt mit CD45-FITC:

Sehen die den Unterschied in der "PE-Expression" der beiden Populationen? Vielleicht in der Vergrößerung:

Lymphozytenpopulation links ohne Antikörper, recht gefärbt mit CD45-FITC:
	Auf der rechten Seite streut die Population in der PE-Expression etwas mehr. Sowohl nach unten als auch nach oben. Dies entsteht durch die Übertragung des Messfehlers aus dem FITC-Kanal in den PE-Kanal. Und der überträgt sich, wie oben beschrieben, durch die Kompensation.

Zugegeben, der Effekt ist nicht besonders groß, weil die Messfehler moderner Geräte meist nicht sehr hoch sind. Aber je höher die Kompensation und je stärker der Messfehler, desto größer ist dieser Effekt.

Ein häufiger Fehler

Wie im vorigen Absatz erklärt, darf die positive Zellpopulation etwas mehr streuen, also eine höhere Verteilungsbreite aufweisen als die negative. Ja das muss eigentlich so sein. D.h. aber, dass auch bei korrekter Einstellung der Kompensation, ein paar Zellen der positiven Population über die Schwelle fallen, die man nach der Negativkontrolle gesetzt hat. Das ist in Ordnung so. Falsch wäre es, die Kompensation so lange zu erhöhen, bis keine Zelle mehr über dieser Schwelle liegt. Ein Beispiel macht dies vielleicht klarer:

	Analyse eines Gemisches CD45-FITC-gefärbter Lymphozyten und ungefärbter Lymphozyten. Die Kompensation ist recht gut eingestellt, die beiden Haufen liegen etwa in gleicher Höhe. Weil die CD45-positiven Zellen aber mehr streuen, liegen ein paar über der Schwelle (Pfeil). Das darf einen aber nicht stören. Das stimmt so.
	Analyse eines Gemisches CD45-FITC-gefärbter Lymphozyten und ungefärbter Lymphozyten. Die Kompensation wurde jetzt höher eingestellt, damit keine Zellen mehr über der Schwelle liegen. Diese Probe ist aber deutlich überkompensiert: der Haufen der CD45-positiven Zellen liegt tiefer als der der negativen Zellen.

Warum man bei Veränderungen der PMT-Spannung die Kompensation ändern muss?

Sie haben die Kompensation FITC-PE korrekt eingestellt. Dann ändern Sie die PMT-Spannung ihrer FITC-PMT und plötzlich stimmt die Kompensation gar nicht mehr.
Auf den ersten Blick könnte man sich fragen, warum? Der Gelbanteil von FITC ist doch immer gleich, egal wie hoch man die PMT-Spannung einstellt.
Ja, der Anteil ist immer gleich. Aber der Messwert, den Sie erhalten, ändert sich nach Veränderung der PMT-Spannung. Und wenn Sie nur die FITC oder nur die PE-PMT-Spannung ändern, dann ändert sich auch der Wert, mit dem Sie kompensieren müssen.

Beispiel:
Sie hatten eine optimale Kompensation bei 20%. D.h., wenn sie bei einer nur FITC-gefärbten Probe ein FITC-Signal von 200 gemessen haben, haben Sie im PE-Kanal 40 gemessen. Sie haben 20% von 200 also 40 vom PE-Signal abgezogen, das ergab 0 und alles war in Ordnung.
Wenn Sie jetzt die FITC-PMT-Spannung vermindern, messen Sie im FITC-Kanal vielleicht nur mehr 160. Aber nicht, weil die Zelle schwächer fluoresziert, sondern nur, weil Sie den FITC-Kanal PMT-Verstärker schwächer eingestellt haben. Den PMT-Verstärker des PE-Kanals haben Sie aber nicht verändert, daher werden Sie im PE-Kanal weiter ein Signal von 40 messen. Eine 20%-Kompensation reicht jetzt nicht mehr aus. 20% von 160 sind 32, wenn Sie 32 von dem PE-Kanal-Signal von 40 abziehen bleiben immer noch 8 übrig. Die Probe ist unterkompensiert.
Vermindern Sie PMT-Spannungen, muss man die Kompensation gegen die Nachbarkanäle erhöhen, erhöhen Sie die Spannung, muss man sie vermindern.