Phosphatidylserin (PS) findet sich normalerweise auf der Innenseite der Zellmembran einer lebenden Zelle. Während der Apoptose (dem "programmierten Zelltod") wird PS auf die Außenseite der Membran transloziert. Annexin V bindet sich an PS. Durch Markierung von Zellen mit FITC-Annexin V kann man apoptotische Zellen durchflusszytometrisch nachweisen.

Werden Zellen nekrotisch und ihre Membran durchlässig, kann FITC-Annexin V in die Zellen eindringen und sich an die Innenseite der Membran binden. Daher können bei alleiniger Färbung von Zellen mit FITC-Annexin V apoptotische nicht von nekrotischen unterschieden werden.

Man kombiniert daher die FITC-Annexin V Markierung mit einer Propidiumiodidfärbung. Das Propidiumiodid (PI) dringt nur in Zellen mit durchlässiger Membran, also in nekrotische Zellen ein.

Lebende Zellen sind daher Annexin-negativ und PI-negativ, apoptotische Zellen sind Annexin-positiv und PI-negativ, nekrotische Zellen sind Annexin-positiv und PI-positiv (siehe Abbildung).

Methode: Wir haben zwei Kits (von der Firma Beckman-Coulter und von Boehringer Mannheim) für die Messung von Apoptose und Nekrose von Zellkulturzellen (Linie monozytäre Zelllinie) unter der Einwirkung eines Zellgiftes und eines Antioxidans eingesetzt.

Ergebnisse: Mit beiden Bestimmungskits gab es reproduzierbare und miteinander vergleichbare Ergebnisse. Unterschiede in der Durchführung der Tests oder im Preis könnten für den einen oder anderen Test sprechen.

250 Bestimmungen

Prinzip:

In frühen Apoptose-Stadien finden Änderungen der Zellmembran statt, u.a. die Translokation von Phosphatidylserin (PS; ist normalerweise nur auf der zytoplasmatischen Innenseite der Membran loklaisiert) auf die Außenseite der Membran. Makrophagen können Phosphatidylserin erkennen, das während der Apoptose an der Oberfläche von Lymphozyten exponiert wird. Das Erkennen und die Phagozytose von apoptotischen Zellen sowie apoptic bodies schützt den Organismus vor der Exposition zellulärer Proteasen, die bei Nekrose freigesetzt werden und zu Entzündungen führen.

Annexin-V ist ein Ca²⁺-abhängiges, Phospholipid-bindendes Protein mit einer hohen Affinität für Phosphatidylserin. Dieses Protein kann somit als empfindliche Sonde für die Phosphatidylserin-Exposition auf der Membranaußenseite aller exprimierenden apoptotischen Zellen eingesetzt werden und ist deswegen zur Detektion apoptotischer Zellen in Zellgemischen geeignet (cave: nicht auf Gewebsschnitten!).

Da nekrotische Zellen durch den Verlust der Membran-Integrität (permeabilisiert) ebenfalls Annexin binden, allerdings schon über dem Apoptosestadium hinaus nekrotisch sind, empfiehlt sich eine Differenzierung der apoptotischen von nekrotischen Zellen durch die Anwendung eines DNA-Farbstoffes, der nur die permeabilisierte Membran nekrotischer Zellen passieren kann, z.B. Propidium-Iodid. Die gleichzeitige Anwendung von Annexin-V-Fluos und PJ gestattet die Diskriminierung nekrotischer Zellen im Annexin-V positiv gefärbten Zellcluster.

Annexin-V (rekombinant) wird in Saccharomyces cerevisiae ("Bäckerhefe"; Stamm TR 1635) produziert. Das Protein wird nach Ammoniumsulfat-Fällung über Phenyl-Sepharose und Heparin-Sepharose gereinigt, Größe ca. 37 kD, pH 4,73

Lösungen:

• Inkubationspuffer: Herstellung einer Lösung, die 10 mM Hepes/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 5 mM CaCl₂ enthält
• Propidium-Iodid-Lösung: Stammlösung mit 50 µg/ml
• Annexin-V-Fluos-Markierungslösung:
  = > 20 µl Annexin-Stammlösung + 1000 µl Hepes-Puffer + 20 µl PJ

• 10⁶ Zellen/ml mit PBS waschen und bei 200 x g 5 Minuten zentrifugieren
• Zellpellet mit 100 µl Annexin-V-Fluos-Markierungslösung resuspendieren, 10 – 15 Minuten inkubieren
• 5 Minuten bei 200 x g zentrifugieren, Überstand abgießen
• Zugabe von 0,4 ml Inkubationspuffer und Analyse am Durchflußzytometer
  (488 nm Exitation, 515 nm Bandpass Filter für Fluorescein-Detektion, Filter > 560 nm für PJ-Detektion)
• Settings FACS-Calibur:
  Det.VoltageAmpGainMode
  FSCE001,00Lin
  SSC3501,20Lin
  FL14861,00Log
  FL25061,00Log
  Threshold:
  FSC 20
  Compensation:
  FL1 - 0,0% FL2
  FL2 - 31% FL1
  

Best. Nr. IM2376 – 200 Bestimmungen

• 10-fach konzentrierter Puffer: 1,7 ml, flüssig
  1:10 mit A. dest verdünnen, im Kühlschrank lagern
• Propidium-Iodid-Lösung: Pulverform, 250 µg/ml
  in 1 ml verdünntem Puffer auflösen
• Annexin-V-FITC: 100 µl, gebrauchsfertig

• Zellgemisch mit eiskaltem Kulturmedium (z.B. RPMI) oder PBS waschen, 5 Minuten bei 500 x g 4°C zentrifugieren
• Überstand abgießen, Zellen in eiskaltem verdünnten Puffer auf 10⁵-10⁶ Zellen/ml einstellen
• Zugabe von jeweils 5 µl Annexin-V-FITC und 5 µl gelöstem PJ zu
  490 µl Zellsuspension
• 10 Minuten lichtgeschützt und gekühlt inkubieren
• Analyse am Durchflußzytometer bzw. Fluoreszenzmikroskop
  (488 nm Exzitation, 515 nm Bandpass Filter für Fluorescein-Detektion, Filter > 560 nm für PJ-Detektion)
  
  
• Settings FACS-Calibur:
  Det.VoltageAmpGainMode
  FSCE001,00Lin
  SSC3501,20Lin
  FL14861,00Log
  FL25061,00Log
  Threshold:
  FSC 20
  Compensation:
  FL1 - 0,0% FL2
  FL2 - 31% FL1
  

Unter bestimmten Bedingungen (in unserem Fall bei einer hohen Konzentration des Zellgiftes und gleichzeitig hoher Konzentration des Antioxidans) zeigen sich auch Propidiumiodid-positive, aber Annexin V - negative Zellen. Eine Konstellation, die es nach dem eingangs beschriebenen Prinzip des Tests gar nicht geben dürfte.

Man würde glauben, dass Zellen deren Membran für PI durchlässig geworden ist, auch Annexin V an der Innenseite der Membranen binden müssten. Dem ist aber offenbar nicht so. Für dieses Phänomen, das auch von anderen beschrieben worden ist, wurden verschiedene Erklärungen vorgeschlagen. Ormerod z.B. meint, dass sich manche Zellen einfach nicht mit Annexin V an der Innenseite anfärben. Tom Frey hypothetisierte, dass Zellen die löchrig werden, ja nicht unbedingt gleichzeitig PI und Annexin "hereinlassen" müssen. Sie könnten ja zuerst für PI, aber erst später für Annexin durchlässig werden.

In jedem Fall werden diese Zellen aber zu den nekrotischen gezählt.